参见：最后生还者角色列表
游戏中主角横跨美国的路线
游戏开场设定于2013年的美国，主角乔尔是一个单身父亲，与他12岁的女儿莎拉住在得克萨斯州。一天晚上，突变的虫草菌肆虐美国，病菌将其人类宿主变成攻击性强且吃人的怪物。乔尔与他的弟弟汤米和莎拉逃离混乱，但莎拉却被一名士兵枪杀。
20年后，人类文明已面目全非，幸存者生活在治安隔离区。住在波士顿隔离区的乔尔与他的朋友泰丝向当地黑帮追讨原本应该给他们的武器，这批武器却被卖给了地下组织火萤。乔尔和泰丝得知真相后杀了那个无赖，却遇上了火萤的首领玛琳。玛琳提出只要他们能将一个14岁的小女孩艾莉，送到议会大厦给火萤护送部队接手，就同意把武器还给他们。虽然当下未说明，但护送期间艾莉坦承三个星期前被感染，却活了下来，她被认为可能拥有研制疫苗的关键。抵达大厦后议会被士兵包围，因稍早袭击而遭到真菌感染的泰丝于是决定牺牲自己为两人拖延时间，并要求乔尔将艾莉送达火萤的手中。
游戏中虚构团体“火萤”的标志
乔尔决定和艾莉去找汤米，他知道火萤的下落。在林肯的朋友比尔的帮助下，他们获得了一辆车。但开车到匹兹堡时，他们被当地武装猎人伏击。他们与兄弟亨利和山姆成为同伴，一同逃离城市。但逃离当夜山姆因被咬伤变异成感染者，亨利杀死山姆后悲伤不已而自杀。
到了秋天，乔尔和艾莉终于在怀俄明州找到汤米，其控制一座水坝。乔尔本考虑由汤米接手艾莉，但最后仍继续和她待在一起。汤米告诉他们实验室位于废弃的东科罗拉多大学，但他们抵达时火萤早已经撤离至盐湖城的圣玛丽医院。当他们打算离开时遭猎人袭击，最后艾莉带着腹部重伤的乔尔逃离。
时间进入冬季，艾莉和乔尔暂住在山上的废弃度假村，乔尔意识不清，需要艾莉的照顾。在猎取一只公鹿时，艾莉遇到大卫和詹姆斯，她从他们手中换得了药品以治疗乔尔，但二人其实是食人族（Cannibals），他们跟踪并抓走了艾莉。她逃脱时杀死了詹姆斯，但是大卫因为中意艾莉而不想杀了她，想让她在食人族待下来。同时略微恢复的乔尔到处寻找艾莉并发现猎人的踪迹，同时间，艾莉在逃脱时差点被大卫杀掉。最后艾莉反杀了大卫，乔尔随后也找到了她，两人一起逃离。
春天，乔尔和艾莉抵达盐湖城，被火萤捕获。在医院里，马琳告诉乔尔，他们必需给艾莉做脑部手术以研制疫苗，艾莉将为此付出生命。但乔尔不愿让艾莉去死，于是救下了手术室中昏睡中的艾莉逃出医院，顺手杀死了马琳并回到汤米的据点生活。路上艾莉醒来后乔尔向艾莉谎称世界上有数十人和艾莉一样对虫草菌免疫，而且火萤虽然找到这些免疫者却根本无法找出治愈虫草菌的方法。艾莉将信将疑，乔尔对艾莉发誓表示自己所说的都是真的。
游戏还提供了下载内容《最后生还者：遗落》互相穿插了两部剧情：在逃离东科罗拉多大学后，重伤的乔尔急需治疗，艾莉为了救他独自冒险前往废弃的购物中心，并从坠落的军队直升机里拾获了宝贵的的急救箱；以及本篇故事发生前（艾莉的回忆），艾莉和好友莱莉最后一次的冒险。莱莉加入了火萤，她与艾莉来到一个废弃的购物中心，告诉艾莉她已被部署到另一城市。艾莉求她留下来。其后她们遭到感染者的追赶，并都被咬伤。两人考虑一起等待死亡，但最终决定度过最后的时刻。